HPLC的檢測(cè)和定量方法

圖 1. 濃度與響應(yīng)的關(guān)系示意圖

其中，A 是峰面積，b 是分析物校準(zhǔn)曲線的斜率，有時(shí)也稱為靈敏度。不同化合物的校準(zhǔn)曲線斜率 b 值可能不同。因此，通常需要為每種必須定量的分析物生成校準(zhǔn)曲線。

為了生成校準(zhǔn)曲線，可以使用分析物的純化合物作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡(jiǎn)稱校準(zhǔn)品），制成不同濃度的溶液。校準(zhǔn)品與樣品無關(guān)，在這種情況下，校準(zhǔn)品可視為外部校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（外部校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品在不同的批次中進(jìn)行分析，而內(nèi)部校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品一起添加和分析）。

在許多實(shí)際應(yīng)用中，最好是在不含分析物的空白樣品中加入不同含量的校準(zhǔn)化合物來進(jìn)行校準(zhǔn)（即含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品）。這種方法可以使含有校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的樣品的分析盡可能接近真實(shí)樣品的分析，并可以在分析中減去基質(zhì)的整體影響。對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的化合物，有時(shí)只使用其中一種化合物的校準(zhǔn)曲線，并根據(jù)相同的校準(zhǔn)品對(duì)不同的化合物進(jìn)行定量。但不建議使用這種方法，只有在無法獲得所有化合物的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)才可使用。

有些線性定標(biāo)不通過原點(diǎn)，因此必須使用以下形式的關(guān)系來計(jì)算峰面積：

大多數(shù) HPLC 檢測(cè)器的峰面積與樣品濃度呈線性關(guān)系。但有時(shí)也會(huì)遇到非線性關(guān)系。非線性可能是由于檢測(cè)器過載造成的，而檢測(cè)器本來應(yīng)該具有線性響應(yīng)。此外，極低濃度的分析物也可能導(dǎo)致非線性響應(yīng)。因此，必須對(duì)整個(gè)濃度范圍進(jìn)行線性驗(yàn)證，尤其要注意極低濃度和極高濃度。熒光檢測(cè)的線性范圍僅對(duì)低濃度有效。熒光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器有時(shí)需要使用非線性校準(zhǔn)曲線。這樣仍然可以直接根據(jù)非線性校準(zhǔn)曲線或使用相應(yīng)的關(guān)系式計(jì)算濃度。不過，在一般情況下，線性校準(zhǔn)曲線更為可取。

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在許多定量技術(shù)中，每次色譜分析都會(huì)引入內(nèi)標(biāo)物（以下簡(jiǎn)稱內(nèi)標(biāo)）。內(nèi)標(biāo)是實(shí)際樣品中不存在的化合物，在分析過程中，在選定的時(shí)間點(diǎn)加入一定量的內(nèi)標(biāo)，用于驗(yàn)證重現(xiàn)性、計(jì)算樣品損失等。內(nèi)標(biāo)的選擇必須使其在分析過程中的表現(xiàn)與分析物盡可能接近，不干擾分析物的測(cè)定，并提供一個(gè)便于積分的色譜峰等。

除了在樣品中加入內(nèi)標(biāo)（如通過樣品制備過程）外，有時(shí)在處理過的樣品中加入色譜標(biāo)準(zhǔn)品也很有用。這種標(biāo)準(zhǔn)品是一種內(nèi)標(biāo)，僅用于驗(yàn)證色譜過程是否正常；它存在于色譜儀的處理過的樣品中。